犬2型腺病毒分离鉴定特分析及鼬獾血清腺病毒抗

摘要:欧阳清波;潘伟好;李平兰;贾玉春;;淡水鱼虾及猪粪便中乳酸菌的分离、鉴定及其药敏性检测[A];北京食品学会2004年论文集[C];2004年 赵鹏;猪繁殖与呼吸综合征病毒在抗体选择压下的变异[...

  欧阳清波;潘伟好;李平兰;贾玉春;;淡水鱼虾及猪粪便中乳酸菌的分离、鉴定及其药敏性检测[A];北京食品学会2004年论文集[C];2004年

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  腺病毒感染在人和多种动物中广泛存在,腺病毒是迄今为止在形态结构、基因组成和复制机理等生物学特性方面研究得最为详尽的病毒之一。目前,犬腺病毒已知有两个血清型CAV-1和CAV-2,虽然两者之间具有免疫交叉保护作用,但它们在病原性和细胞嗜性方面均不相同。这两种血清型腺病毒基因组的同源性在57%~70%之间。CAV-1毒力较强,可以在脉管上皮细胞中繁殖,并引起以犬肝炎或狐狸脑炎为特征的全身性感染,偶尔引起狗或狐狸死亡。CAV-2则可以引起上呼吸道感染和肠道症状。CAV-1最早由Green于1925年从患有脑炎的狐狸中分离得到,1962年Dithfield分离到世界上第一株CAV-2即Toronto A26/61株,随后发现CAV-1也能引起单纯的呼吸道疾病,因此认为犬腺病毒2型可能是1型的变异株。直到1985年Hamelin和1988年Macartney证实犬2型腺病毒又可在犬消化道上皮增殖引起腹泻,进一步证明了犬腺病毒的遗传变异。本实验首次从犬子宫上皮组织分离到的犬2型腺病毒则可能是犬腺病毒组织亲嗜性又一次发生改变的新的变异株。 本研究通过对长春某养殖场一发病死亡犬解剖发现,犬子宫上皮组织表面有出血点,对处理后的犬子宫病料进行病毒分离纯化,并对分离纯化的病毒进行了常规生物学和分子生物学鉴定以及理化学特性鉴定分析。首先将无菌处理后的样品接种MDCK细胞,将病变后的细胞冻融两次收获病毒,然后以终点稀释法初步纯化病毒。利用纯化病毒接种细胞后的病变细胞培养物进行电镜负染观察,以区分犬腺病毒1型和2型的特异性引物PCR扩增鉴定,并进行细胞敏感谱和红细胞血凝谱测试,在完成病毒理化学特性鉴定的同时,进行动物回归实验观察接种动物的临床症状和病理变化。实验结果表明,病变犬子宫上皮组织匀浆物能使MDCK细胞发生腺病毒典型葡萄串状细胞病变,电镜观察可见二十面体立体对称的病毒粒子。病毒增殖能被5-碘脱氧尿核苷所抑制,对、胰酶不敏感,对酸(pH3.0)和热(50℃)有一定抵抗力,能够凝集人红细胞和大鼠红细胞,但不凝集豚鼠红细胞,用犬腺病毒特异性引物可以扩增出与CAV-2阳性对照相同大小的核酸片段。分离纯化的病毒通过口鼻接种SN效价为0的5条2月龄幼犬,最终3条死亡,病理组织切片观察可见扁桃体、肺脏和子宫组织病变明显。将病变的扁桃体组织、肺部组织和子宫上皮组织无菌匀浆处理物分别接种MDCK细胞,3天后均出现腺病毒典型葡萄串状细胞病变,电镜负染观察可见典型二十面体立体对称的腺病毒样粒子,未见其他病毒样粒子;弱毒对照组幼犬保持正常。可见所分离到的病毒是一株可以感染犬子宫的毒力较强的犬2型腺病毒,命名为CC0710株。 腺病毒衣壳由三个主要结构蛋白构成:纤突、六邻体和五邻体。本实验提取分离腺病毒CC0710株和犬2型腺病毒国内分离株YCA-18株的腺病毒基因组,设计了针对腺病毒三个主要衣壳蛋白的引物,分别进行PCR扩增并测序。测序结果显示,YCA-18株与Toronto A26/61株主要衣壳蛋白序列几乎完全一致,而分离的CC0710株与这两株相比具有明显差异。纤突蛋白在腺病毒感染过程中发挥重要作用,介导病毒与宿主细胞受体的结合。腺病毒纤突可分为小节、基轴、尾区三个结构功能区。病毒依靠纤突小节与细胞表面的特异性受体相结合,纤突小节与腺病毒的组织亲嗜性密切相关;纤突基轴由脯氨酸和疏水性氨基酸残基组成,含有6-23个β-折叠结构,纤突基轴的长短也影响病毒的趋向性;尾区是最保守的部位。对于犬2型腺病毒CC0710株、TorontoA26/61株和YCA 18株,纤突N端的1~42位氨基酸构成尾区,中间的43~365位氨基酸构成包括18个重复β-折叠结构的基轴,纤突C末端的366~542位氨基酸构成节区。犬2型腺病毒国内分离株YCA-18株与国外分离的标准参考毒株Toronto A26/61株纤突蛋白没有差异。犬2型腺病毒CC0710株与Toronto A26/61株、YCA 18株相比,纤突的22处突变核苷酸导致6处氨基酸突变,其中纤突小节和尾区各有1处突变氨基酸,另外4处突变氨基酸位于基轴,其中位于小节的突变氨基酸由非极性氨基酸甘氨酸变为极性带负电荷氨基酸天冬氨酸,氨基酸性质变化较大。因此初步推测纤突蛋白尤其是纤突小节中的突变氨基酸可能与分离腺病毒CC0710株组织亲嗜性改变甚至毒力增强有关。六邻体蛋白是结构最大、数量最多的腺病毒衣壳蛋白,构成整个腺病毒粒子的衣壳表面。五邻体在病毒的内化过程中发挥作用,可与细胞内的整合素结合。CC0710株与Toronto A26/61株相比,六邻体的30处突变核苷酸导致2处氨基酸变异,五邻体仅有1处非极性氨基酸变异,这3处突变氨基酸对于腺病毒的毒力及组织亲嗜性影响较小。分离毒株纤突蛋白氨基酸的变异并未引起原有潜在糖基化位点N-X-S/T的改变。突变氨基酸与分离毒株组织亲嗜性变异以及毒力增强的关系需要进一步研究证明。 鼬獾是一种在我国东南部地区分布广泛的重要野生肉食动物,为了调查鼬獾血清的犬腺病毒抗体水平,本实验利用分离的犬2型腺病毒对于采自广州、南昌、临安的45份鼬獾血清进行了犬腺病毒血凝抑制效价测定,这三个地区的犬腺病毒血凝抑制效价测定结果不同。 本实验自患病死亡犬的病变子宫内分离获得一株可以引起幼犬呼吸道和子宫病变的毒力较强的犬2型腺病毒,发现其纤突蛋白中重要氨基酸的突变,通过利用分离犬2腺病毒的血凝抑制实验表明所测地区的鼬獾血清犬腺病毒血凝抑制效价不同。

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